[摘要] 目的 探討脑胶质瘤组织中P-糖蛋白（P-gp）、多药抗药性相关蛋白（MRP）、乳腺癌耐药相关蛋白（BCRP）的表达及临床意义。 方法 选择2007年7月～2016年7月于武安市第一人民医院手术切除的脑胶质瘤标本56例作为观察组，同期脑外伤的正常脑组织10例作为对照组。应用免疫组织化学SP法检测两组标本中的P-gp、MRP、BCRP表达情况，并分析其与脑胶质瘤患者的临床病理特征的关系。 结果 观察组P-gp、MRP、BCRP阳性表达率分别为42.86%（24/56）、76.79%（43/56）、46.43%（26/56），均明显低于对照组的0.00%（0/10）、10.00%（1/10）、0.00%（0/10）（P < 0.01）。脑胶质瘤组织P-gp、MRP、BCRP阳性表达率与肿瘤病理分期、组织学分级有关，病理分期越高，P-gp、MRP、BCRP阳性表达率越高；组织学分级越低，P-gp、MRP、BCRP阳性表达率越高，差异均有统计学意义（P < 0.01）。Spearman等级相关分析显示，脑胶质瘤组织P-gp阳性表达率与MRP、BCRP阳性表达率呈正相关（Rs = 0.612、0.537，P < 0.05）。 结论 脑胶质瘤组织中P-gp、MRP、BCRP均呈高表达，其表达水平与肿瘤病理分期、组织学分级有关，且三者表达呈正相关。
[关键词] 脑胶质瘤；P-糖蛋白；多药抗药性相关蛋白；乳腺癌耐药相关蛋白；免疫组织化学法
[中图分类号] R739.41 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）12（b）-0012-04
[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of P- glycoprotein （P-gp）， multidrug resistance associated protein （MRP） and multidrug resistance associated protein （BCRP） in brain gliomas. Methods Fifty-six cases of brain glioma resected in the First People"s Hospital of Wuan from July 2007 to July 2016 were selected as the observation group， and 10 normal brain tissues of brain trauma in the same period were selected as control group. The expressions of P-gp， MRP and BCRP in specimens of two groups were detected by immunohistochemistry （SP）， and the relationship between the expression and clinical pathological features of glioma was analyzed. Results The P-gp， MRP， BCRP positive expression rates of the observation group was 42.86% （24/56）， 76.79% （43/56）， 46.43% （26/56）， respectively， was significantly lower than the control group of 0% （0/10）， 10% （1/10）， 0% （0/10） （P < 0.01）. The positive rates of P-gp， MRP and BCRP in glioma was related to the pathological stage and histological grade of glioma， the higher the pathological stage， the higher the positive expression rate of P-gp， MRP and BCRP. The lower the histological grade， the higher the positive expression rates of P-gp， MRP and BCRP， and the differences were statistically significant （P < 0.01）. Spearman rank correlation analysis showed that the positive rate of P-gp expression in glioma tissues was positively correlated with the positive rates of MRP and BCRP （Rs = 0.612， 0.537， P < 0.05）. Conclusion The expressions of P-gp， MRP and BCRP are highly expressed in gliomas， and the expression level is related to the pathological stage and histological grade， and the three expressions are positively correlated.
[Key words] Brain glioma； P-glycoprotein； Multidrug resistance associated protein； Breast cancer resistance related protein； Immunohistochemistry
脑胶质瘤是临床上最为常见的中枢神经系统原发肿瘤之一，约占颅内肿瘤的50%[1]。该病具有较高的发病率，且近年来发病率呈逐年上升趋势[2]。目前，临床上对于脑胶质瘤主要是采用手术治疗，但由于脑胶质瘤恶性程度较高，多呈浸润性生长，肿瘤边界不明显，仅通过手术治疗难以达到完全切除的效果，术后常需要辅助化疗、免疫治疗等[3]。近年来，随着肿瘤多药耐药性的发生，化疗药物敏感性逐渐下降，导致患者预后不良[4]。P-糖蛋白（P-gp）是多药耐药基因编码的一种单链跨膜糖蛋白，与化疗耐药密切相关[5]。而多药抗药性相关蛋白（multidrug resistant proteins，MRP）和乳腺癌耐药相关蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）是目前已知的与化疗耐药相关的重要蛋白，不仅影响脑胶质瘤化疗效果，也可能与肿瘤恶性程度有关[6]。鉴于此，本研究探讨脑胶质瘤组织中P-gp、MRP、BCRP的表达及临床意义，目的在于进一步分析上述指标与胶质瘤的病理级别关系，从而为脑胶质瘤的化疗提供新的靶点与思路。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2007年7月～2016年7月武安市第一人民医院（以下简称“我院”）手术切除并经病理诊断确诊的脑胶质瘤标本56例，其中男32例，女24例；年龄20～72岁，平均（41.2±6.2）岁；根据Ann Arbor系统对所有患者进行临床病理分期：Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期26例；组织学分级：低分化19例，中、高分化37例。入选标准：①患者临床资料完整；②本次就诊为脑部疾病初次就诊，术前未经任何放化疗。排除标准：①同时患有其他系统肿瘤患者；②肾、肝功能异常患者；③颅内退行性病变患者；④既往有神经、精神系统疾病病史。同时选取同期因外伤切取的正常脑组织标本10例作为对照组，其中男6例，女4例；年龄18～70岁，平均（36.75±5.35）岁。两组性别、年龄差异无统计学意义（P > 0.05），有可比性。患者均签署了知情同意书，本研究经我院医学伦理委员会批准。
1.2 主要试剂
P-gp小鼠抗人单克隆抗体，MRP小鼠抗人单克隆抗体，液体DAB酶底物显色试剂盒，4%中性甲醛溶液以及SP-9002免疫组化试剂盒。上述试剂购自广州安必平医药科技股份有限公司。PBS缓冲液购自北京武警总医院病理实验室。
1.3 免疫组织化学SP法
所有标本均经5%福尔马林固定、液体石蜡包埋，冷却，制成4 μm厚度连续切片。并应用免疫组织化学SP法检测两组标本中的P-gp、MRP、BCRP表达情况，具体方式如下：梯度酒精脱水，PBS缓冲液冲洗，高温高压抗原修复，PBS缓冲液冲洗，加入生物学一抗过夜，山羊血清封闭，加入生物学二抗，DAB显色，梯度酒精水化，苏木精复染，中性树胶封片。具体操作严格按照试剂盒说明书进行。取已知P-gp、MRP阳性切片为阳性对照，以PBS替代一抗为阴性对照。
1.4 结果判定标准
脑组织细胞质与细胞膜内存在棕黄色颗粒记为P-gp、MRP阳性，随机选取5个高倍镜视野，视野中阳性细胞数占比<10%记为阴性，阳性细胞数占比≥10%记为阳性[7]。
1.5 统计学方法
采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，并应用Speraman相关分析相关性，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组P-gp、MRP、BCRP表达情况比较
观察组P-gp、MRP、BCRP阳性表达率均明显高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表1。
2.2 脑胶质瘤组织中P-gp阳性表达率与患者病理特征关系分析
脑胶质瘤组织中P-gp阳性表达率与患者的性别、年龄无关（P > 0.05）；病理分期Ⅲ～Ⅳ期、组织学分级为低分化脑胶质瘤患者的P-gp阳性表达率均明显高于病理分期为Ⅰ～Ⅱ期、组织学分级为中、高分化者，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表2。
2.3 脑胶质瘤组织中MRP阳性表达率与患者病理特征关系分析
脑胶质瘤组织中MRP阳性表達率与患者的性别、年龄无关（P > 0.05）；病理分期为Ⅲ～Ⅳ期、组织学分级为低分化脑胶质瘤患者的MRP阳性表达率均明显高于病理分期为Ⅰ～Ⅱ期、组织学分级为中、高分化患者，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表3。
2.4 脑胶质瘤组织中BCRP阳性表达率与患者病理特征关系分析
脑胶质瘤组织中BCRP阳性表达率与患者的性别、年龄无关（P > 0.05）；病理分期为Ⅲ～Ⅳ期、组织学分级为低分化脑胶质瘤患者的BCRP阳性表达率，均明显高于病理分期为Ⅰ～Ⅱ期、组织学分级为中、高分化患者，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表4。
2.5 脑胶质瘤组织中P-gp、MRP、BCRP表达的相关性
Spearman等级相关分析显示，脑胶质瘤组织P-gp阳性表达率与MRP、BCRP阳性表达率呈正相关（Rs = 0.612、0.537，P < 0.05）。
3 讨论
脑胶质瘤的发病率在所有颅内肿瘤中位居首位，临床主要采用手术治疗[8]。但由于脑胶质瘤恶性程度较高，仅通过手术治疗难以达到根治效果，患者术后复发率较高，有研究报道显示，脑胶质瘤患者术后平均生存期为1年[9]。而术后化疗在脑胶质瘤的综合治疗过程中具有积极作用。近年来，随着化疗的广泛应用，肿瘤多药耐药发生率逐渐升高，化疗敏感性降低，成为患者预后不良的重要原因。因此，如何有效提高化疗效果是目前临床上备受关注的热点。分子生物学研究显示[10-11]，脑胶质瘤细胞中部分耐药基因及其产物的表达水平是导致化疗耐药的主要机制。其中P-gp是多药耐药基因编码的跨膜糖蛋白，可以通过外转运机制将多种化疗药物泵出细胞外，降低化疗敏感度[12]。而MRP则可以通过与化疗药物中的葡萄糖醛酸甙形成共轭化合物，降低化疗敏感度[13]。BCRP属于ATP结合转运蛋白，则可以介导20多种化疗药物的耐药[13]。以上三种分子可能影响脑胶质瘤的生物学行为。
本研究通过对脑胶质瘤标本和正常脑组织比较发现，脑胶质瘤标本P-gp、MRP、BCRP阳性表达率均明显高于正常脑组织，差异均有统计学意义。这与Jeibmann等[14]的研究报道相一致，表明了脑胶质瘤组织中P-gp、MRP、BCRP均呈高表达。此外，脑胶质瘤患者病理分期为Ⅲ～Ⅳ期、组织学分级为低分化患者的P-gp、MRP、BCRP阳性表达率均明显高于病理分期为Ⅰ～Ⅱ期、组织学分级为中、高分化患者。证实了脑胶质瘤组织P-gp、MRP、BCRP阳性表达率与肿瘤病理分期、组织学分级有关。目前有研究报道显示[15]，P-gp能够泵出秋水仙碱、依托泊苷、长春新碱等药物；其可通过外排转运机制将通过细胞膜的亲脂性药物泵出细胞外，从而降低化疗药物的作用效果。MRP不仅属于能量泵之一，同时亦是谷胱甘肽偶合泵之一，可介导化疗药物中的葡萄糖醛酸甙共轭物、硫酸盐共轭物以及谷胱甘肽硫共轭物排出细胞，进一步引发耐药的产生[16-17]。同时，MRP主要定位于细胞膜，参与了细胞质内囊泡的运输，进一步导致药物亚细胞分布的改变，从而促使化疗药物不能与其靶点结合，最终导致了耐药的产生[18]。BCRP属于ATP结合盒转运蛋白超家族成员之一，作为细胞膜上的药物排出泵，其能排出20多种细胞毒性药物，从而对药物作用产生极大的影响[19-20]。本研究结果进一步表明，P-gp、MRP、BCRP可能在脑胶质瘤的发生、发展过程中发挥着至关重要的作用。同时，Spearman等级相关分析显示，脑胶质瘤组织P-gp阳性表达率与MRP、BCRP阳性表达率呈正相关。笔者推测P-gp、MRP、BCRP可能通过相互影响，从而促进脑胶质瘤的发生、发展、侵袭和耐药，其具体机制有待于进一步研究证实。本结果也提示临床上可以通过对P-gp、MRP、BCRP干预，降低化疗的耐药性，为人脑胶质瘤的化疗提供新的方法，也为抗肿瘤药物的研制提供了新思路。
综上所述，脑胶质瘤组织中P-gp、MRP、BCRP均呈高表达，临床上可通过对上述三项指标表达情况进行检测，从而为脑胶质瘤患者的诊断、治疗以及预后评估提供参考依据。
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（收稿日期：2017-10-19 本文编辑：任 念）