摘要：目的 探讨RhoA及微血管密度（MVD）与宫颈癌发生发展的关系。方法 采用免疫组织化学SP法，分别测定16例正常宫颈组织、20例宫颈上皮内瘤变组织、50例宫颈鳞癌组织中RhoA蛋白及CD34的表达。结果 ①宫颈鳞癌组RhoA的阳性表达与宫颈上皮内瘤变组和正常宫颈组比较有明显差异（P<0.001；P<0.001）。②宫颈鳞癌组MVD值与宫颈上皮内瘤变组和正常宫颈组比较有明显差异（P<0.001；P<0.001）。③Ⅱ期宫颈鳞癌RhoA和MVD的阳性表达分别与Ⅰ期比较，差异有统计学意义（P<0.05）。组织学分级G3 RhoA和MVD的阳性表达分别与G1RhoA和MVD比较有明显差异（P<0.05）。宫颈鳞癌淋巴结转移组RhoA的阳性表达与无淋巴结转移组比较，无明显差异（P>0.05），MVD比较也无差异（P>0.05）。<35岁的年轻宫颈癌患者中RhoA的阳性表达率与≥35岁的宫颈癌患者比较，差异有统计学意义（P<0.001）。两组患者MVD值比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 在宫颈癌发生发展中，RhoA的表达增强和MVD增高可能发挥了重要作用。
关键词：宫颈癌；RhoA；CD34；微血管密度；肿瘤转移
The Expression of RhoA and CD34 in Cervical Squamous Cell Carcinoma and Clinical Significance
ZHANG Ping1，DAI Juan2，FAN Ling-hua1，MAO Xi-guang1
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，The Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou 646000，Sichuan，China；2.Department of Obstetrics and Gynecology，Panzhihua City Central Hospital，Panzhihua 617000，Sichuan，China）
Abstract：Objective To estimate the expressions of RhoA and microvessel density（MVD）in squamous carcinoma of the cervix（SCC）， cervical intraepithelial neoplasia （CIN） and normal cervical epithelium（NCE） and evaluate the possible mechanism in the invasion of cervical carcinoma. Methods In 16 NCE cases，20 CIN cases and 50 SCC cases， immunohistochemical S-P method had been used to examine the expression levels of RhoA and CD34. Results ①The expression level of RhoA was significantly higher in SCC than in CIN and NCE（P<0.001，P<0.001）.② The MVD was significantly higher in SCC than in CIN and NCE（P<0.001， P<0.001）.③ In comparison to stage ⅠSCC， the expression levels of RhoA and MVD in stage Ⅱ were significant difference（P<0.01；P<0.01）. In comparison to G1 SCC， the MVD and the expression levels of RhoA in G3 had significant difference（P<0.05；P<0.001）. In comparison to the without lymph nodal metastasis group， the expression levels of RhoA and MVD in SCC with lymph node metastasis group was no significantly different（P>0.05；P>0.05）. The expression levels of RhoA in more than 35 years old was higher than in less than 35 years old， there was significant difference（P<0.001）， but MVD was no significantly different in the two groups（P>0.05）. Conculusion RhoA might be a key role in the invasion and metastasis of squamous carcinoma of the cervix. The increase of microvessel density is closely related to the progression of tumor. Their levels maybe act as clinical referential indexes in the progression of cervical carcinoma.
Key words：Cervical cancer； RhoA； CD34； Microvessel density； Neoplasm metastasis
宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，每年新增宫颈癌患者80%发生于发展中国家[1]，目前其发病还有年轻化趋势[2]。宫颈癌的主要特点是侵袭转移，这也是导致宫颈癌患者死亡的主要原因。近年研究发现一些与宫颈癌侵袭转移相关的基因如Rho[3-4]等在肿瘤的侵袭和转移中发挥了重要作用。本研究采用免疫组化SP法检测RhoA和CD34在宫颈癌组织中的表达情况，探讨RhoA表达改变及微血管密度与宫颈癌侵袭转移的关系。
1资料与方法
1.1一般资料 标本取自2010年1月～2012年12月在我院妇科手术切除宫颈病理组织标本，其中宫颈上皮内瘤变组织20例；宫颈鳞癌标本50例（淋巴结有转移者16例，淋巴结无转移者34例）；鳞癌组织学分级：G1 27例，G2 13例，G3 10例；FIGO分期：Ⅰ期31例，Ⅱ期19例。随机选择16例同期因子宫肌瘤行全子宫切除的正常宫颈标本作对照。患者年龄27～65岁，中位年龄43.4岁。全部病例术前均未接受放疗、化疗。
1.2主要实验试剂 兔抗人RhoA多克隆抗体，鼠抗人CD34单克隆抗体、链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）免疫组化染色试剂盒均购自北京中山金桥生物技术有限公司。
1.3方法 采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（Streptavidin-peroxidease， SP）免疫组化技术。所有新鲜标本均用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，选择典型病灶连续切片，片厚4 μm，做免疫组化染色。SP法检测不同宫颈组织中RhoA和CD34的表达情况。以PBS代替一抗作为阴性对照，用公司提供的阳性切片作为阳性对照。
1.4阳性结果判定标准
1.4.1 RhoA染色结果判定标准 RhoA免疫组织化学显色为棕黄色颗粒，分布于肿瘤细胞的细胞质。评分标准按Martin-Villar[5]等的方法，根据染色强度及阳性细胞百分率进行评分，每张切片随机选取5个典型肿瘤细胞视野（×400），每个视野计数100个肿瘤细胞，各自计算100个肿瘤细胞中阳性细胞数量和着色强度分别记录，取平均值。评分方法如下：①根据细胞着色强弱（记为a）计分：不着色（阴性）为0分，浅黄色（弱阳性）为1分，棕黄色（阳性）为2分，棕褐色（强阳性）为3分。②根据阳性细胞百分比（记为b）着色细胞百分率1%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，75%～100%为4分。③a与b乘积为HIS评分，0分为（-），1～4分为（+），5～8分为（++），9～12分为（+++）。统计分析时（-）记为阴性，（+）-（+++）记为阳性。
1.4.2 MVD阳性结果判定标准 MVD的测定方法：参照Weidner等[6]的方法：以血管内皮细胞呈棕色或棕黄色为CD34阳性。切片在100倍光镜下挑选微血管分布最高密度区域，在200倍光镜下计数5个不重复视野中被CD34染成棕黄的微血管数，取其平均值作为MVD。每个与邻近微血管明显分离的阳性染色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇都视为独立的微血管；只要结构不相连，其分支结构也计作一个血管计数。直径大于8个红细胞直径的血管，有厚的平滑肌的血管不在计数范围内。
1.5统计学分析 采用t检验、方差分析、秩和检验及Spearman秩相关。取α=0.05（双侧）作为检验水准。统计结果用SPSS 13.0软件分析。
2结果
2.1 RhoA蛋白在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变及宫颈鳞癌中的表达 RhoA蛋白表达主要定位于细胞胞浆，以胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性。高分化鳞癌细胞中主要表达淡黄色颗粒，低分化鳞癌中主要表达棕黄色颗粒，随分化程度降低颗粒颜色逐渐加深；CIN组RhoA蛋白在异型细胞胞浆的中表达为淡黄色颗粒；正常宫颈组上皮细胞胞浆中未见RhoA蛋白的阳性表达。见图1、图2、图3。
图3 RhoA在宫颈鳞癌中的阳性表达（×400倍）
3讨论
RhoA是近年来研究较多的一类转移促进基因，RhoA蛋白是Rho蛋白家族中的重要成员之一，其主要作用有：增加肌动-肌球蛋白的收缩力，调节细胞骨架，促使肿瘤细胞在细胞外基质中迁移[7]；通过调节转录因子促进细胞周期素D1的表达，促进细胞从G1期进入S期，从而促进肿瘤细胞的增殖；降低细胞间粘附作用，为细胞的迁移提供可能；促进细胞外基质的降解，促进肿瘤细胞局部浸润；促进肿瘤血管的生成，协助肿瘤细胞穿越血管内皮细胞向远处转移等[8]。同时，在肿瘤浸润和转移中，微血管增生是必不可少的条件之一。血管内皮细胞增生、黏附并与细胞外基质黏附形成新生微血管，为肿瘤细胞提供营养和转移路径[9-10]。微血管密度（MVD）是临床上协助判断肿瘤恶性程度和预后的重要的生物学指标[11]，微血管密度增高与肿瘤的进展、预后不良有密切关系[12]。本实验结果显示 RhoA蛋白在正常宫颈组织中无表达，在CIN和宫颈鳞癌组织中的表达逐渐增强，并且随着宫颈鳞癌分化程度的降低，RhoA的阳性表达率逐渐增高，提示RhoA在宫颈癌的发生发展中可能起发挥促进作用。本实验发现正常宫颈组织血管分布规则、均匀，微血管血管少。癌组织内血管分布不均，微血管形态异常，管腔大小不一，基底膜不完整，弥漫分布于癌组织间，说明血管密度增大能为癌肿提供更多的营养支持，促进肿瘤浸润和转移。
本实验发现RhoA的表达与宫颈鳞癌组织学分级、淋巴结转移、患者年龄、临床分期有关，虽然淋巴结转移和组织学分级没有纳入宫颈癌的临床分期，但普遍被妇科肿瘤学者承认的是组织学分级和淋巴结转移是影响宫颈癌预后的重要因素[13]。Jiang[14]等研究发现RhoA的表达水平与乳腺癌的病理组织分级、淋巴结转移呈正相关；于月成[15]等发现在上皮性卵巢癌及有转移的淋巴组织中RhoA高表达，且RhoA的阳性表达与肿瘤分化程度、淋巴结的转移和短生存期相关；顾颖[16]等研究发现宫颈癌中RhoA的阳性表达与组织学分级及淋巴结转移相关。这与本实验结果一致。实验同时显示随着临床分期增加、恶性程度增高，MVD值逐渐增多并表现出明显差异。推测随宫颈鳞癌恶性程度增高，在RhoA和其他某些因素作用下，血管内皮细胞增生形成新生血管，为肿瘤细胞提供更多的营养支持和转移路径，促进肿瘤细胞增殖和转移。
本实验还发现，在从正常宫颈组织到宫颈浸润癌的发生发展中，RhoA和MVD成上调趋势，RhoA表达水平的上调使肿瘤细胞降解基底膜及细胞外基质，在侵袭、转移过程中突破各种屏障如子宫颈上皮细胞的基底膜、血管基底膜和淋巴管基底膜的能力增强，同时，MVD增多使肿瘤细胞获得更多的营养，促进肿瘤的生长，有利于转移发生。
由上可见，RhoA可能通过破坏肿瘤细胞间的粘附作用，降解细胞外基质，加快肿瘤新生血管的生成，促进肿瘤细胞增殖和转移。我们可以通过干扰RhoA的表达，影响肿瘤的生物学特性，包括影响细胞的增殖、分化、粘附、浸润等多个环节，从而增加对宫颈鳞癌患者的治疗效果和改善预后。
参考文献：
[1]Parkin DM ，Bray F，Ferlay J ，et al. Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2002，55（2）：74-108.
[2]赵玲，耿力，董兆文.国内外宫颈癌的发病状况及趋势[J].中国计划生育学杂志，2003，8（11）：509-511.
[3]黄可金，宿长磊，耿佳时.宫颈癌转移的基因调控研究进展[J].国际遗传学杂志，2009，4（32）：278-281.
[4]王江，李侠，章翔.Rho亚家族在肿瘤细胞增殖、侵袭和转移中的作用[J].中华神经外科疾病研究杂志，2008，7（6）：561-563.
[5]Boissan M， Dabernat S， Peuchant E， et al. The mammalian nm23/NDPK family： from metastasis control to cilia movement[J]. Mol Cell Biochem，2009，329（1-2）：51-62.
[6]Weidner N. Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer[J].Am J Pathol， 1995 ， 147（1）：9-19.
[7]Gervaise L，Patrice G，Pierre P. Rho kinases in cardiovascular physiology and pathophysiology[J]. Circ Res，2006，98（3）：322.
[8]郁玲玲，顾建英.Rho亚家族在肿瘤侵袭中的作用研究进展[J].复旦学报（医学版），2010，37（5）：617-619.
[9]Laidler P，Gil D，Pituch-Noworolska A，et al.Expression of betal-integrins and N-cadherin in bladder cancer and melanoma cell lines[J].Acta Biochim Pol，2002，47（4）：1159-1170.
[10]Prifti S， Zourab Y，Koumouridis A，et al.Role of integrin in invasion of endometrial cancer cell lines[J].Gynecol Oncol，2002，84（1）：12-20.
[11]魏丽军，李建民，李瑞玲.宫颈癌微血管计数和血管内皮生长因子的表达[J].中国药物与临床，2004，4（5）：344-346.
[12]Kodama J，Seki N，Tokumo K，et al.Vascular endothelial growth factor is implicated in early invasion in cervical cancer. Eur J Cancer[J]. 1999， 35（4）：485-489.
[13]蒋乐萍.宫颈癌患者淋巴结转移的影响因素分析[J].实用癌症杂志，2013，28（6）：731-733.
[14]Jiang WG， Watkins G， Lane J， et al. Prognostic value of Rho GTPase and Rho guanine nucleotide dissociation inhibitors in human breast cancers[J]. Clin Cancer Res，2003，9（15）：6432-6440.
[15]于月成，辛晓燕，吴维光，等.Rho和ROCK蛋白在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义[J].现代肿瘤医学，2006，14（4）：461-464.
[16]顾颖，韩素萍，张晔.RhoA、RAC1在宫颈癌组织中的表达及其临床意义[J].苏州大学学报（医学版），2008，28（1）：115-118.
编辑/肖慧